基因高通量测序

基因高通量测序包括:1.miRNA测序、 2.lncRNA测序、3.宏基因组测序、4.外显子组测序、 5.转录组测序、6.全基因组甲基化测序、7.全基因组重测序

添加时间:

2016年12月30日

代谢组学技术

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腺病毒、慢病毒与逆转录病毒表达系统的构建和包装

基因高通量测序包括:

1.miRNA测序、 

2.lncRNA测序

3.宏基因组测序

4.外显子组测序

5.转录组测序

6.全基因组甲基化测序、

7.全基因组重测序


高通量测序详情介绍


一、miRNA测序

 


1、服务介绍

microRNA(miRNA)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA,是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成,不同于siRNA(双链)但是和siRNA密切相关。microRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻译,从而在转录后水平调控蛋白表达(最新发现miRNA也能在转录水平调控基因表达)。miRNA在物种进化中相当保守,在动物、植物和真菌等中发现的miRNA表达均有严格的组织特异性和时序性。miRNA在细胞生长和发育过程中起多种作用,包括调控发育、分化、凋亡和增殖等。

目前研究miRNA的方法主要是realtime-PCR、生物芯片技术以及第二代测序技术。基于第二代测序技术的miRNA测序,可以一次获得数百万条miRNA序列,能够快速鉴定出不同组织、不同发育阶段、不同疾病状态下已知和未知的miRNA及其表达差异,为研究miRNA对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具。

 

2、分析项目

标准分析项目

1) 原始数据质控(去接头污染,去低质量reads),数据产出统计;

2) 与参考序列比对;

3) 小RNA与rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、piRNA的比对信息;

4) 小RNA与miRBase 中指定范围的已知的 miRNA的比对;

5) 按照优先级将小RNA进行分类注释;

6) 预测新的miRNA;

7) 差异miRNA分析;

8) 差异miRNA表达聚类分析;

9) miRNA靶基因预测分析

10) 靶基因功能富集分析

 

高级分析项目(以下分析选择分析结果较好的3~5个)

靶基因蛋白互作网络分析

miRNA功能协同网络分析

miRNA通路协同网络分析

miRNA共调控网络分析

miRNA活性分析

按照客户要求对兴趣miRNA进行深入分析;

重要miRNA的功能富集分析;

 

3、样本要求

RNA样品总量: ≥3μg

RNA样品浓度: ≥200 ng/μL

 

4、项目周期

58个工作日





二、 lncRNA测序

 

1、服务介绍

长链非编码RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)一般是指长度大于200 nt的RNA,位于细胞核内或胞浆中,不参与蛋白质编码功能,以RNA形式在多种层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控基因的表达水平,在生命活动中具有重要作用。

长链非编码RNA测序(long non-coding RNA sequencing,lncRNA-Seq)是一种使用特定方法降低样本中rRNA 的丰度,对富集到的 RNA进行文库构建,再对高通量测序仪产出的数据进行信息分析的研究方法。lncRNA-Seq可一次性获得样本中几乎全部的lncRNAs信息,对lncRNAs的类别、功能进行全方位的深入分析,从而快速全面准确地获得与特定生物学过程(例如发育、疾病等)相关 lncRNA信息。

 

2、数据分析内容

标准分析项目

1) 去除接头序列、低质量序列,得到高质量数据;

2) 与核糖体数据库比对,去除核糖体RNA(rRNA)数据

3) 转录本组装;

4) 鉴定已知转录本(包括已知lncRNA)和新转录本;

5) 预测新的lncRNA;

6) lncRNA定量及差异分析(需至少2个样品);

7) lncRNA差异表达模式聚类;

高级分析项目

基于互补序列的lncRNA-mRNA互作分析;

构建重要的lncRNA-mRNA网络图;

网络拓补学分析及网络模块分析;

功能富集分析;

ceRNA预测分析;

 

3、样品要求

1.样品类型:细胞、新鲜组织或RNA样品。

2.样品量:细胞样品请提供至少1×107个细胞,组织样品请提供至少300mg的组织块或切片,RNA样品请提供10 μg以上的总RNA。

3.样品质量:RNA无明显降解,提取的总RNA OD260/280值在1.8~2.2之间,浓度≥ 500 ng/μl,28S:18S ≥ 1.5,RIN ≥7。

4.样品保存:细胞样品或新鲜组织块(切成~50mg的小块)可用TRIZOL或RNA保护剂处理或液氮冻存后,-80℃保存。RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中,-80℃保存。样品保存期间避免反复冻融。

5.样品运输:样品置于1.5 ml管中,封口膜封好,干冰运输。






三、宏基因组测序


1、服务介绍

牛启生物宏基因组学研究不要求对每个微生物进行分离纯化培养,而是直接从样品中提取基因组DNA后进行测序分析。通过宏基因组测序,能够解释微生物群落多样性、种群结构、进化关系、功能活性及环境之间的相互协作关系,极大地扩展了微生物学研究范围。环境微生物多样性检测是指通过对环境中微生物16S rDNA高变区/ITS 的PCR扩增产物进行高通量测序,分析该环境下微生物群落的多样性和分布规律。

 

2、分析项目

标准分析项目

1. 去除宿主污染,产出数据及质控统计

2. 组装前,通过K-mer分析评估样品的测序深度

3. 序列组装

4. 基因组结构注释(串联重复序列注释、短回文重复序列注释、可变遗传因子注释、基因编码区域预测、NCBI NR库比对、致病岛预测、前噬菌体预测、毒力因子预测,可选)

5.基因功能注释(GO功能注释,KEGG通路注释,Swissprot数据库注释、COG功能分类)

6.比较基因组分析(基因家族分析,系统进化树构建,物种分期时间预测)

7. 生物种类和丰度估计

8. 样本间群落结构比较(多样本);

9. 微生物生物分布与环境关联分析(多样本);

 

3.高级分析项目

重要结论的获得;

聚类分析;

主成分分析;

通路富集分析;

功能富集分析;

个性化分析





四、外显子组测序(exome-seq)

 

1、服务介绍

外显子组测序(exome-seq)是对定向富集的基因组DNA进行高通量测序,它能够以相对低的费用对人类外显子组进行拷问。2009年,外显子组捕获工具的出现,让外显子组测序这种技术迅速红起来。到目前为止,已有超过1万个外显子组被测序。

如今有多家公司推出了外显子组捕获试剂,包括罗氏NimbleGen、安捷伦、Illumina,还有最近的华大基因。这些方法究竟孰优孰劣,斯坦福大学医学院遗传学系的研究人员对市场上三个主流的外显子组测序平台进行了比较。该研究结果发表在《Nature Biotechnology》上。研究人员利用安捷伦、Illumina和NimbleGen的外显子组测序平台对同一个人类血液样品进行分析。他们的结 果表明,NimbleGen平台作为唯一一个使用高密度重叠探针的平台,尽管覆盖了较少的基因组区域,但在灵敏检测小的变异时所需的测序量也最少。在同样获得80M测序数据的情况下,NimbleGen有97%的目标序列达到10x以上的测序深度,而其他产品只有90%。而安捷伦和Illumina的探针能够在低密度下捕获更多数量的变异。此外,Illumina还捕获了未翻译的区域,这是NimbleGen和安捷伦平台无法靶定的。研究人员还比较了同一样品的外显子组测序和全基因组测序(WGS),显示外显子组测序能够检测到WGS错过的小变异。

除了文中提到了三个主流平台,外显子组捕获方面的新产品也在不断推出,研究人员的选择也将更广泛。罗氏NimbleGen即将推出新一代的外显子液相捕获产品。这一新产品将可捕获64M的基因组序列,包括所有外显子以及miRNA,它含与其他NimbleGen液相捕获产品相同的2.1M高密度探针,以确保高效、均一、特异、全面的定向捕获。

为了让研究人员更轻松更经济地利用定向外显子组测序,Illumina提供了TruSeq Exome EnrichmentKit,一种溶液型的序列捕获方法,利用杂交选择分离出人类基因组中的目的外显子区域。TruSeq Exome Enrichment Kit提供了迄今为止最为全面的外显子组覆盖度。

 

 

2、分析项目

标准分析项目

1. 数据质控和筛选

2. 与参考基因组比对,得到测序深度Reads分布和覆盖度统计

3.SNP、small Indel检测

4.SNP、small Indel矫正

 

3.高级分析项目

可信位点筛选;

体细胞突变位点筛选(癌症)

位点注释(邻近基因区域与功能注释、邻近结构域注释、邻近顺势调控区域注释、编码区内位点的变异类型;变异位点保守性检测、变异位点风险评估)

数据集图片类型统计(多样本)

变异位点区域分布(多样本)

高频变异位点/基因统计(多样本)

GWAS分析(大样本量)

 





五、转录组测序


1、服务介绍

转录组即某个物种或特定细胞在某一功能状态下产生的所有RNA的总和,是研究细胞表型和功能的一个重要手段。与基因组不同的是,转录组的定义中包含了时间和空间的限定。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下,其基因表达情况是不完全相同的。转录组测序(RNA-Seq)是指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序,全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。相对于传统芯片而言,RNA-Seq无需预先设计探针,即可对任意物种的任意细胞类型的转录组进行检测,能够提供更精确的数字化信号,更高的检测通量以及更广泛的检测范围,是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。

 

2、操作流程

1. 全转录组总RNA提取;

2. mRNA分离和文库构建;

3. 高通量测序;

4. 数据处理与生物信息学分析;

5. 测序报告生成

 

3、生物信息分析

(一)无参考基因组序列的转录组

1. 标准信息分析

1) 对原始数据进行去除接头序列及低质量reads的处理;

2) 数据产出统计及测序数据的成分和质量评估;

3) 进行基因表达定量分析

4) 组装结果分析;

5) Unigene功能注释及COG分析;GO分类;pathway分析;NR分析;Swissprot分析

6) Unigene表达差异分析;

7) 差异基因的表达模式聚类分析

8) 差异表达基因的GO功能富集分析和Pathway富集性分析;

9) 差异表达基因的蛋白互作网络分析;

10) SNP分析


2. 高级分析

转录调控网络分析,及网络图构建和重要TF分析;

通路交互网络分析,重要通路分析。

差异表达基因共表达分析,构建网络图

转录因子活性分析,预测最重要的转录因子;

基因共上游调控元件预测

miRNA预测,预测调控靶基因的重要miRNA

主成分分析

 

(二)有参考基因组序列的转录组

1. 标准信息分析

1) 对原始数据进行去除接头污染序列及低质量 reads 的处理

2) 参考基因组比对

3) 进行基因表达定量分析

4) 可变剪切分析(真核)

5) 新转录本预测:新mRNA和新lncRNA预测

6) 差异表达基因分析(2个或者2个以上的样本)

7) 差异基因的表达模式聚类分析

8) 差异基因的GO功能富集分析和KEGG PATHWAY富集分析

9) 差异基因的蛋白互作网络分析

10) SNP分析

 

4. 高级分析

lncRNA-mRNA表达关联性分析,及网络图构建;

转录调控网络分析,及网络图构建和重要TF分析;

通路交互网络分析,重要通路分析。

差异表达基因共表达分析,构建网络图

转录因子活性分析,预测最重要的转录因子;

基因共上游调控元件预测

miRNA预测,预测调控靶基因的重要miRNA

主成分分析

药物小分子预测分析(适用于人类),得到最相关的药物小分子。

 

5、样品要求

1)样品类型:细胞、新鲜组织或RNA样品。

2)样品的量:细胞样品请提供至少1×107个细胞,组织样品请提供至少300mg的组织块或切片,RNA样品请提供10 μg以上的总RNA。

3)样品质量:RNA无明显降解,提取的总RNA OD260/280值在1.8~2.2之间,浓度 ≥ 500 ng/μl,28S:18S ≥ 1.5,RIN ≥ 8。

4)样品保存:细胞样品或新鲜组织块(切成~50mg的小块)可用TRIZOL或RNA保护剂处理或液氮冻存后,-80℃保存。RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中,-80℃保存。样品保存期间避免反复冻融。

5)样品运输:样品置于1.5 ml管中,封口膜封好,干冰运输。

 

 


六.全基因组甲基化测序


七.全基因组重测序

 

 


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