实验原理：

细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期测定细胞周期的方法很多，最常用的是PI渗入测定细胞周期。PI ,即碘化丙锭,可以与细胞内DNA 和RNA 结合,采用RNA酶将RNA消化后,通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的PI 的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA 含量不同,通常正常细胞的 G0/G1 期具有二倍体细胞的DNA含量(2N) ,而G2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N) ,而S 期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此,牛启生物通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA 含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为 G0/G1 期,S 期和G2/ M 期,并可通过特殊软件计算各时相的百分率。

操作步骤：

1. 收获细胞于流式管中，加入3-4ml的PBS清洗细胞。 

2. 1000rpm离心10分钟，弃上清。 

3. 逐滴加入5ml或更多预冷的70-80%的乙醇，涡旋混匀细胞， 4°C避光过夜（>18小时）。 

4. 1000-1500rpm 离心细胞10分钟，弃上清。之后清洗细胞2次以去除所有的乙醇。 

注：第一次用1x PBS，第二次用染色液（货号：554656）。 

5. 细胞染色：每管样本需10^6细胞。具体操作如下： 

1) 对于PI/RNase 染色，将细胞重悬于0.5 mL PI/RNase 染色液（货号：550825）。 

2) 对于7-AAD染色，将细胞重悬于0.1 mL 染色液（货号：554656），同时加入20 μL7-AAD染色液（货号：559925） 

6. 室温避光孵育15分钟。

7. 分析前4℃避光保存样本。1小时之内上流式细胞仪检测。

样本制备注意事项：

• 获得单个细胞，尽量避免DNA的降解

• 样本最关键的就是减少碎片（EDTA/不可过度吹打/离心rpm）

• PI既能与DNA结合，又能与RNA结合，所以要用RNase降解

• PI质量及RNase所加量很重要，建议用商品化试剂

• 污染脱氧核糖核酸酶会降解DNA，故玻璃器皿和试剂要干净灭菌

样本检测注意事项：

• 进样速度：一般检测细胞浓度调整为2E5–2E6/ml，进样速度为低速。若峰形较宽，可能就是进样速度太快

• 仪器质控定期做，尽可能排除因机器设置引起的峰形加宽

• 排除粘连细胞（FL2-A/FL2-W）

• 通过电压脉冲信号的宽度和面积区别实体组织标本中的粘连细胞群体，最大程度的减少粘连细胞带来的假阳性结果