免疫组化服务-免疫组化技术服务-免疫细胞化学技术

免疫组化服务-免疫组化技术服务,抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质).

添加时间:

2016年10月08日

CCK8检测细胞增殖/毒性技术服务-科研技术服务

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甲基化检测-高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melt,HRM)

实验原理:

免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),牛启生物对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。



免疫组化步骤(ABC法)

1.4%多聚甲醛常规灌注固定,取材并置20%蔗糖溶液(4℃)中。蜡块制作。切片,贴片。0.01MKPBS清洗5min×3后; 

2.加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液(甲醇80ml+0.01MKPBS 100ml+30%过氧化氢)30min,以消除内源性过氧化物酶的影响,0.01MPBS清洗5min×3; 

3.加入配好的0.3% Triton X100(30% Triton X100+0.01MKPBS 100ml)30min,以增加细胞的通透性,0.01MKPBS清洗5min×3; 

4.加入用血清稀释液(牛血清白蛋白1.00g+0.01MPBS 100ml+叠氮纳0.08g)稀释的一抗,4℃存放24-48h;吸去抗体,0.01MKPBS洗5min×3; 

5.加入0.01MKPBS稀释的的二抗,室温孵育2h。0.01MKPBS洗5min×3; 


测序实验流程:

免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自显影法等。


 免疫组化(LP 法)操作步骤

1.切片常规脱蜡至水。如需抗原修复,可在此步后进行

⒉ 缓冲液洗 3min/2 次。

⒊ 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色,将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。

⒋ 缓冲液洗 5min/2 次。

⒌ 滴加 Ultra V Block , 在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。

(注:孵育不要超过 10 分钟,否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 - 10% 正常羊血清,这一步可以省略。)

⒍ 缓冲液洗 5min/2 次。

⒎ 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 - 2 小时。(具体孵育时间和温度由试验者最终决定)

⒏ 缓冲液洗 5min/2 次。

9 . 滴加 Primary Antibody Enhancer(增强子),在室温下孵育 20 分钟。

10 .缓冲液洗 5min/2 次。

11 .滴加 HRP Polymer(酶标二抗) ,在室温下孵育 30 分钟。

(注:HRP Polymer 对光敏感,应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。)

12 .缓冲液洗 5min/2 次。

13 .向 1ml DAB Plus Substrate (或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen (或 AEC Plus Chromogen),混匀后滴加到切片上,孵育 3 - 15 分钟。(具体时间由染色深浅决定。)

14 .自来水充分冲洗,复染,脱水,透明,封片。


免疫组化SP法步骤:

1.烤片,68℃,20分钟,

2. 常规二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水;二甲苯I 20min --二甲苯II 20 min--100%酒精I 10min --100%II 10min --95% 5min-- 80% 5min-- 70% 5min 

3.阻断 灭活内源性过氧化物酶:3%H2O2 37℃孵育10min,PBS冲洗3X5min;

4. 抗原修复:置0.01M枸橼酸缓冲液(PH 6.0)中用煮沸(95℃,15-20min),自然冷却20min 以上,再用冷水冲洗缸子,加快冷却至室温,PBS冲洗3X5min。

5. 正常羊血清工作液封闭,37℃10 min,倾去勿洗.

6. 滴加一抗4℃ 冰箱孵育,PBS冲洗3X5min(用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照);

滴加生物素标记二抗, 37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;

7. 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液,37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;

8. DAB/ H2O2反应染色,自来水充分冲洗后,

苏木素复染,常规脱水,透明,干燥,封片。



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