免疫荧光技术服务(Immunofluorescence technique )-免疫荧光抗体

免疫荧光技术服务(Immunofluorescence technique )又称免疫荧光抗体,是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。

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2016年12月08日

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实验原理:

     免疫荧光技术服务(Immunofluorescence technique )又称免疫荧光抗体,是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合,利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。



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实验流程:

1,切片,烤片60℃,1h;

2,脱蜡及复水

二甲苯10min,100%乙醇5min,95%乙醇5min,90%乙醇5min,85%乙醇5min,80%乙醇5min, 75%乙醇5min,60%乙醇5min,50%乙醇5min,30%乙醇5min,自来水1min,双氧水1min;

3,1份30%H2O2加10份蒸馏水,室温10min,蒸馏水洗3次,每次3min;

4,微波修复

将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液,微波中最大火力(98℃-100℃)加热至沸腾,冷却(约5-10min),反复两次;

5,将切片自然冷却至室温,PBS洗涤3次,每次5min;

6,封闭,5%BSA,室温20min,甩去多余液体;

7,滴加一抗,37℃,1h,或者4℃过夜;

8,PBS洗涤3次,每次3min;

9,滴加二抗,37℃,15-30min;

10,PBS洗涤3次,每次3min;

11,滴加SABC,37℃, 30min;

12,PBS洗涤3次,每次5min;

13,1ml蒸馏水中分别滴加显色剂,混匀;

14,DAB显色剂配置好后,滴加于切片,室温,镜下检测反应时间(约5min);

15,自来水冲洗干净,过蒸馏水;

16,苏木素复染2min,自来水冲洗;

17,脱水

30%乙醇3min,50%乙醇3min,70%乙醇3min,80%乙醇3min,90%乙醇3min,95%乙醇3min,100%乙醇3min,二甲苯20min;

18,树胶封片,镜检。


免疫荧光实验常见问题:

1.问:免疫荧光:用免疫荧光方法做同样的内容,组织切片和培养细胞,两者操作过程中有哪些不同?

参考见解:只是固定方法不同,细胞固定用甲醇,切片固定用多聚甲醛,而染色方法是一样的.

2.问:近期要做免疫荧光双标,不知哪位有免疫荧光双标技术的详细步骤以及注意事项

牛启生物参考见解;我正在做冰冻组织切片的免疫荧光的双染。有些体会:

       1.选取primary antibodies时要来源于两种不同的动物,我用的是来源于rabbit和rat的抗体,secondary antibodies则是不同荧光信号标记的,我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。

       2 我的做法是两种primary antibodies同时孵育,然后两种secondary antibodies同时孵育。抗体浓度、孵育时间要认真摸索,我感觉primary antibodies 4度孵育过夜比较好,背景比较干净。

       3 我的阳性对照采用的是阳性组织切片,阴性对照则分别是rabitt和rat的IgG, 荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。

       4 Block用的血清使secondary antibody来源动物的血清,我的是10%的正常donkey血清。

       5 其余同一般操作。


3. 问:本人拟做Brdu标记神经干细胞免疫荧光,二抗为FITC标记,想请教各位大侠

       1、抗体分装、及荧光显微镜观察结果是否一定要在暗室中进行实验?

       2、封片时是否用甘油缓冲液即可,还是用甘油和0.5mmol/lPH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液等量混合封片?

       3、有无相应的实验方法参照?

       4、免疫酶染色中的3%过氧化氢及2N盐酸是否还需要用?

牛启生物参考见解:你的二抗是用FITC标记的,为避免荧光分解,分装及荧光显微镜观察时均要避光;

       2、封片最好用甘油加0.5mmol/lPH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液,后者能使玻片透明‘更亮;

       3、关于免疫酶染色,如果是用过氧化物酶做标记,就必须用3%H2O2以去除内缘性过氧化物酶;

       4、如果要做苏木素复染,可用盐酸溶液去除苏木素。


4. 问:做间接法免疫荧光染色,要怎么设置对照?不是很明白

参考见解:最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照,看是否非特异性染色

       空白对照:如果你作的是石蜡切片的免疫组化,这一个对照必须有,目的是看自发荧光.脱蜡后直接在荧光显微镜下观察.

       2.阴性对照:标本直接滴加二抗,呈阴性反应.

       3.抗原对照:标本加同种动物的未免疫血清,以PBS冲洗后,在加抗免疫球蛋白荧光抗体.因未免疫动物的血清中无特异性抗体,应呈阴性反应.


5. 问:我做乳腺组织的免疫荧光染色,结果用激光共聚焦显微镜看很好,有阳性信号,阴性对照组也没有荧光,但是拿到荧光纤维镜下看,我的阴性对照组一片绿,像非特异性染色,到底哪个结果才是真实的呢?

参考见解:激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高的多,出现上述现象首先要排除荧光显微镜的问题,如是不是紫外灯泡寿命到期了或者别的原因,荧光显微镜没有问题,那就以共聚焦显微镜的结果为主!


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