细胞增殖存活检测-MTT法细胞活性检测

细胞增殖存活检测-MTT法细胞活性检测,其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。

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2016年10月08日

免疫共沉淀(Co-IP)技术-科研技术服务

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CCK8检测细胞增殖/毒性技术服务-科研技术服务

实验原理:

MTT是一种粉末状化学试剂,全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,汉语化学名为 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝,是一种黄颜色的染料。MTT主要有两个用途:(1)药物(也包括其他处理方式如放射线照射)对体外培养的细胞毒性的测定;(2)细胞增殖及细胞活性测定。


MTT方法能简单、快捷、准确地测定细胞的增殖反应,并且其价格低廉,成为目前牛启生物检测细胞活性的首选方法之一。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值,在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)来判断活细胞数量,OD值越大,细胞活性越强(如果是测药物毒性,则表示药物毒性越小)。



一、MTT 溶液的配制


1、MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。


市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g。对于100mg这样的小包装,厂家都是将MTT放入小管中的,个人建议不要再用天平称量分装,而应该一次性将其全配制成溶液,如100mg用20mlPBS来溶解。具体做法:预先在50ml离心管(没有的话,可用培养瓶替代)加入20ml PBS,从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中,吹打若干次后将其移入50ml离心管,然后再混匀。可以重复几次,以使小管中的MTT不残留于管内。将MTT完全混匀后,用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20℃。按细胞培养板每孔需加10ul计算,一般每96孔板约需1ml,所以分装时可考虑每管分装1ml。对于大包装,可按上述方法称取一部分溶解,也有人将粉剂分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加。


2、注意事项:


(1)在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。


(2)配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感。


(3)MTT一般最好现用现配,过滤后4℃避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。


(4)MTT有致癌性,使用时需小心。


二、MTT甲瓒溶解液


1、二甲基亚砜DMSO:可以直接溶解,无需配制,使用方便,溶解速度快,但对人体毒性较大,且需去除原培养液,在去除培养液的过程中,可能会把结晶去掉,导致结果不稳定。


2、三联溶解液:SDS10g,异丁醇5ml,10M HCl 0.1ml,用双蒸水溶解配成100ml溶液,该溶解液不需去除原培养基,但溶解较慢。该溶解液因含有SDS,在低温保存的时候易产生结晶,因此在用之前必须提前几小时拿至室温,将SDS结晶全部溶解后再使用。


三、MTT法实验步骤


1、胰酶消化对数期细胞,终止后离心收集,制成细胞悬液,细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。


2、将细胞悬液制备好后,轻轻混匀,每孔加入100ul, 这样待测细胞的密度为5000—10000/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。


注意:因细胞在混匀后仍要继续沉降,因此接种的过程中要反复多次混匀,如每加6个孔就混匀一次,以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同,这对于MTT的结果至关重要。


3、将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物。原则上,细胞贴壁后即可加药(两小时——半天时间),但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药。一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔,建议设6个,否则难以反应真实情况。 


注意:对于加药,有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中,以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好,然后将96孔板中的培养上清去掉(可以用排枪吸走)再加入100ul含不同浓度药物的培养基,这样能保证药物浓度的准确。另外,需注意的是,如果用这种方法,不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药,应该吸完一部分后立即加样,避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。


4、5%CO2,37℃孵育16-48h,倒置显微镜下观察药物的作用效果。 


5、每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。 


6、终止培养,准备溶解结晶。


溶解结晶的方法有两种,用DMSO溶解:


1)用DMSO溶解: MTT加入培养4h后,结晶可充分形成。将上清去掉,该过程要注意不能把Formazan结晶移走。有人直接用移液器将上清移走,也有人建议先铺几张滤纸在桌面,然后将96孔板轻轻倒置,这样上清便被滤纸吸走,以减少结果的损失。 


2) 每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。


另一种方法,用三联溶解液:


1) MTT加入培养4h后,结晶可充分形成。这种方法细胞上清可以不用去掉,直接在每孔加入100ul溶解液。(该溶解液因含有SDS,在低温保存的时候易产生结晶,因此在用之前必须提前几小时拿至室温,将SDS结晶全部溶解后再使用。)


2) 放入培养箱中继续孵育4—6小时,镜下观察,待结晶全部溶解后570nm测吸光度。通常37℃孵育4小时左右,紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少,溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多,溶解的时间会长一些。


7、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。


四、MTT结果分析


关于如何计算IC50 ——改良寇式法:lgIC50=Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4]


Xm:lg 最大剂量


I:lg(最大剂量/相临剂量)


P0:阳性反应率之和


Pm:最大阳性反应率


Pn:最小阳性反应率



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