实验原理：

双向凝胶电泳是将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率分离的分析方法。成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离，是目前唯一的同时能分离成百上千种蛋白质的工具。牛启生物通过对蛋白质双向电泳的图谱扫描，用相关软件（PDQUEST等）进行图谱差异分析，找到差别点。然后把差别点切出，进行脱色、酶解。最后样品进入质谱测试，得到质谱原始数据文件。通过搜库可得到差别点蛋白质的详细信息，主要用于药物开发、细胞差异分析、癌症研究、疾病标志物的检测、蛋白质组分析等。

技术服务内容

 1、双向电泳样本制备与定量；

  2、双向电泳与图片分析； 
     3、蛋白质斑点质谱鉴定；
      4、双向电泳实验报告提交。

送样须知：

 1. 基本要求：双向电泳技术服务系统可以分离任何类型的样本，如组织、细胞、细菌等材料。本公司接受任何类型的样本，对于不同的样本需要的量有所不同，具体需要量请咨询本公司。
  2.运输要求：液氮或干冰保存寄送，深圳本地客户可上门收样。
 注：样本应避免各类污染和反复冻融。

双向电泳各步骤注意事项：

1. 总的策略

① 化学试剂纯度要高，至少是分析级，目前国产试剂达不到纯度要求
       ② 使用去离子水(电导<2uS)
       ③ 尿素和丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺需新鲜配制
       ④ Deionize urea prior to use
       ⑤ 包含尿素的溶液加热温度不超过 37℃，否则会发生蛋白质氨甲酰化; 过滤所有的溶液，使用干净无灰尘的容器

2. 样品制备

① 样品提取缓冲液(裂解缓冲液)必须新鲜配制。或者分装成 1ml，于-78℃冷冻保存， 裂解缓冲液一旦溶解不能再冷冻
       ② 如有必要，在细胞裂解时加入蛋白酶抑制剂。牛启生物提醒您注意：几种蛋白酶抑制剂在 DTT 或b-巯基乙醇存在时失效
       ③ 40000g 离心 1 小时以去除蛋白提取液中的不溶物

3. 灌胶

① 过硫酸铵溶液需新鲜配制。40%过硫酸铵溶液储存于冰箱中只能使用 2-3天，低浓度过硫酸铵溶液只能当天使用
       ② TEMED 需在氮气下储存，每 6 个月换一次
       ③ 带 U 型框的玻璃板需用疏水硅烷处理，避免胶聚合后与玻璃板粘连
       ④ 水平 SDS 浓缩胶中加入甘油(37.5%)的目的是为了减少电内渗
       ⑤ 如果 SDS 胶结合于 GelBond PAG 膜上， GelBond PAG 膜需用去离子水洗 6 次，每次 10 分钟， 以避免银染过程中产生点托尾

4. IPG 胶条的水化

① PG 胶条需水化到 0.5mm 厚
       ② IPG 胶条的的水化时间取决于水化缓冲液的组成。如果尿素(>8M)和去污剂(>1%)浓度过高，至少需水化 6 小时，最好过夜 
       ③ 采用 Multiphor II 做第一向电泳时，水化后的 IPG胶条需用去离子水清洗，否则 IPG 胶条表面会有尿素结晶，干扰 IEF。(使用 IPGphor 时，IPG胶条水化后不必清洗) 
       ④ IPG 胶条水化时，其胶面与水化盘或胶条槽之间避免产生气泡。采用胶条槽水化时，胶条上需覆盖硅油以防水化液挥发

5. 第一相 IEF

① 采用样品杯上样：样品体积不能少于 20μl 样品在阴极或阳极附近上样，未知样品需检查在何处上样，结果更好；样品浓度不能过高(最大 10mg/ml)，以避免在上样位置生成蛋白沉淀。如果怀疑，最好用裂解缓冲液稀释，增大上样体积 样品溶液中不能含高浓度的盐。脱盐或用裂解缓冲液稀释，低电压使样品慢慢进入胶中

② 水化时加入样品 样品溶液体积需根据 IPG胶条大小调整(18cm长 IPG胶条约需 400μl样品溶液)，以保证水化后没有多余的样品留在水化盘中。最好检查高分子量蛋白、碱性蛋白或膜蛋白是否进入 IPG胶中

③ 等电聚焦 使用 IPG 胶条时，不要进行预聚焦，否则会因为胶的电导非常低导致样品很难进入胶条；为使样品进入胶的效率增加，采用 30V 低电压水化；继续以低电压梯度(200V，500V，1000V 各 1 小时)进行电泳，最后达到 8000V 的进行电泳；聚焦时间跟 IPG 胶条的长度、pH 范围有关。短的 IPG胶条或宽 pH 梯度范围 IPG 胶条，聚焦时间短 IEF 结束后，如果 IPG 胶条暂时不进行第二向电泳，可于-78℃  冷冻保存；上样附近有水析出是因为样品盐浓度过高，可脱盐或稀释样品，低电压上样，延长样品进入胶的时间

6. IPG 胶条平衡和第二相(SDS-PAGE)

       ① 平衡时间应该充分长(至少 2 x 10 分钟)
       ② 平衡缓冲液包括 Tris-HCl(pH8.8),SDS(1%),高浓度尿素(6M)和甘油(30%)提高蛋白质的溶解度并减少电内渗。第一步加入 DTT(1%)是为了使蛋白去折叠；第二步加入碘乙酰胺是为了去除多余的 DTT(银染过程中，DTT 会导致点拖尾)
       ③ 对于非常疏水的蛋白或含有二硫键的蛋白，相对于 DTT 和碘乙酰胺，tributylphosphine 更有效
       ④ 水平的 SDS-PAGE：浓缩胶中加入大量的甘油(37%)是为了减少电内渗
       ⑤ 水平的 SDS-PAGE：浓缩胶的长度至少超过 25mm
       ⑥ 蛋白从一向(IPG 胶条)到二向(SDS 胶)的转移为避免点拖尾和损失高分子量蛋白，应缓慢进行(场强<10V/cm)

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